Penyerang Serbia, Aleksandar Mitrovic, sukses mencetak gol kemenangan timnya pada menit ke-90.
Hasil ini membuat Portugal gagal lolos secara otomatis ke Piala Dunia karena finis di urutan kedua klasemen Grup A dengan 17 poin.
Mereka terpaut 3 poin dari Serbia yang menjadi juara grup.
Adapun Portugal harus melalui fase play-off untuk bisa lolos ke Piala Dunia.
Cristiano Ronaldo cs nantinya akan memperebutkan sisa tiga tiket putaran final Piala Dunia 2022 pada Maret tahun depan.
Baca Juga: Mimpi Buruk Italia, Bisa Ketemu Swedia Lagi di Play-off Kualifikasi Piala Dunia 2022
Selepas pertandingan tersebut, Fernando Santos mengaku bertanggung jawab atas hasil minor ini.
"Para pemain sudah mencoba, tapi kami tidak menghidupkan permainan," kata Santos seperti dikutip BolaSport.com dari Goal International.